2.3.3.2.4 Koloniehybridisierung

Bei vielen rekombinanten Kolonien erfolgt zunächst eine Einschränkung der in Frage kommenden Kolonien durch die sog. Koloniehybridisierung. Dabei geht man von einer Kultivierungsplatte aus, auf der nur noch rekombinante Kolonien vorliegen.

Man startet mit ca. 200 Transformanten auf einer Petrischale. Diese Transformanten sollten bereits aufgrund einer Antibiotikaresistenz und einer Insertionsinaktivierung auf das Vorhandensein von Plasmid und inserierter Passagier-DNA überprüft worden sein. Die Kolonien werden auf einen gleichgroßen Nitrocellulosefilter replikaplattiert ("abgestempelt"). Die ursprüngliche Petrischale wird als Originalplatte aufbewahrt. Der Cellulosefilter muß so markiert werden, daß später eine Zuordnung der Kolonien möglich wird.

Die Klone läßt man nun zu ca. 2 mm großen Kolonien auswachsen, indem man den Filter auf ein Nährmedium legt. Danach transferiert man den Filter auf ein Löschpapier, das mit Natronlauge getränkt wurde. Die Lauge lysiert die Zellen und fixiert gleichzeitig die freigewordene und nun einzelsträngige DNA auf dem Filter. Nach mehreren Waschvorgängen werden die Filter im Vakuum zwei Stunden bei 80 °C inkubiert ("gebacken"). Dieses Procedere bindet die DNA irreversibel auf die Filter. Als Gensonde dient eine 32P-markierte DNA, RNA oder ein Oligonukleotid mit 15 bis 30 Nukleotiden. Man kann auch eine nick translation-Probe verwenden, die entweder mit ³²P oder Tritium markiert ist. Die Gensonde muß dabei komplementär zu einem Teil des einen Strangs der gesuchten Passagier-DNA sein. Der Filter wird in einer Lösung mit der radioaktiven Probe inkubiert. Nach der Hybridisierung wäscht man die Filter mit einer Pufferlösung um unspezifische Doppelstränge zu dissoziieren. Die trockenen Filter werden auf einen Röntgenfilm aufgelegt und 12 bis 72 Stunden exponiert. Auf dem Radiogramm kann man dann die positiven, d. h. radioaktiv markierten, Kolonien identifizieren. Da manchmal die radioaktive Gensonde auch unspezifisch an Zelltrümmern (evtl. auch nach dem Waschen) haftet, bedeutet nicht jeder schwarze Fleck im Autoradiogramm, daß das gesuchte Gen vorliegt.

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Abb. 57: Ablauf der Koloniehybridisierung mit ³²P

Aus den noch in Frage kommenden Kolonien, die auf der Ausgangsplatte identifiziert werden können, werden mit Hilfe sog. mini preps (Präperationen im Mini-Maßstab) die Plasmide isoliert und jeweils die Länge der eingebauten fremden DNA-Fragmente ermittelt: Hierzu wird durch durch sog. Doppelverdauung mit den gleichen beiden Restriktionsenzymen die zur Klonierung verwendet wurden, das jeweilige eingebaute DNA-Fragment wieder aus dem Vektorplasmid freigesetzt. Bei bekannter Länge des gesuchten Gens ist so eine deutlich weitere Einschränkung der fraglichen rekombinanten Kolonien möglich.