2.3.4.1.2 Kettenabbruch durch Dideoxy-Nukleotide: Unterschied zwischen den Versionen
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Die zu sequenzierenden DNA-Fragmente werden auf vier Reaktionsansätze verteilt. In jedem Restriktionsansatz kommen DNA-Polymerase I, alle 4 NTPs und jeweils eine Nukleotidsorte zusätzlich in dd-Form (weniger als die "normalen" Nukleotide). Dadurch findet ein Kettenabbruch statistisch in jedem Fragment statt, jedoch an unterschiedlichen Stellen. | Die zu sequenzierenden DNA-Fragmente werden auf vier Reaktionsansätze verteilt. In jedem Restriktionsansatz kommen DNA-Polymerase I, alle 4 NTPs und jeweils eine Nukleotidsorte zusätzlich in dd-Form (weniger als die "normalen" Nukleotide). Dadurch findet ein Kettenabbruch statistisch in jedem Fragment statt, jedoch an unterschiedlichen Stellen. | ||
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| + | Dann werden die synthetisierten Doppelstränge denaturiert, also getrennt, und die Einzelstränge für jeden Ansatz getrennt in einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von Harnstoff[2] aufgetrennt. | ||
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| + | Nach dem Auftrennen wird auf das Gel ein Röntgenfilm im Dunklen aufgelegt. Nach seiner Entwicklung zeigen sich Schwärzungen durch die entsprechenden Banden des Gels. Die sequenzierte Basenabfolge kann dann ermittelt werden, indem von unten nach oben die Banden durchgegangen werden und die zugehörigen Nukleotide in 5' → 3'-Richtung geschrieben werden. | ||
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| + | Nachteile dieser Methode sind die Verwendung radioaktiver Stoffe (teuer, gesundheitsschädigend und umweltbelastend), der aufwendige Arbeitsaufwand und die Tatsache, daß je Probe nur vier Ansätze und vier Geltaschen verwendet werden können. Daher ist keine Automatisierung dieser Methode sinnvoll. | ||
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| + | [2]: verhindert die Renaturierung der Einzelstränge zu Doppelsträngen</small> | ||
Aktuelle Version vom 21. November 2008, 22:48 Uhr
Normale Nukleotide (dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) haben eine OH-Gruppe am 3'-Ende gebunden. Dideoxy-Nukleotide[1] (ddNTPs: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) haben hingegen keine OH-Gruppe am 3'-Ende gebunden und können daher auch nicht an weitere Nukleotide binden. Es erfolgt ein Kettenabbruch.
Die zu sequenzierenden DNA-Fragmente werden auf vier Reaktionsansätze verteilt. In jedem Restriktionsansatz kommen DNA-Polymerase I, alle 4 NTPs und jeweils eine Nukleotidsorte zusätzlich in dd-Form (weniger als die "normalen" Nukleotide). Dadurch findet ein Kettenabbruch statistisch in jedem Fragment statt, jedoch an unterschiedlichen Stellen.
Beispiel:
- Ausgangsfragment:
- 3' CTT AGC TAA GAG 5'
- Möglichkeiten für den unteren Strang nach der DNA-Polymerase-Reaktion im ddA-Behälter (A*):
5' GA* 3' (2 Nukleotide)5' GAA* 3' (3 Nukleotide)5' GAA TCG A* 3' (7 Nukleotide)5' GAA TCG ATT CTC 3' (kein dd-Nukleotid wird eingebaut; 12 Nukleotide)
- Möglichkeiten für den unteren Strang nach der DNA-Polymerase-Reaktion im ddC-Behälter (C*):
5' GAA TC* 3' (5 Nukleotide)5' GAA TCG ATT C* 3' (10 Nukleotide)5' GAA TCG ATT CTC* 3' (12 Nukleotide)5' GAA TCG ATT CTC 3' (kein dd-Nukleotid wird eingebaut; 12 Nukleotide)
- Möglichkeiten für den unteren Strang nach der DNA-Polymerase-Reaktion im ddG-Behälter (G*):
5' G* 3' (1 Nukleotid)5' GAA TCG* 3' (6 Nukleotide)5' GAA TCG ATT CTC 3' (kein dd-Nukleotid wird eingebaut; 12 Nukleotide)
- Möglichkeiten für den unteren Strang nach der DNA-Polymerase-Reaktion im ddT-Behälter (T*):
5' GAA T* 3' (4 Nukleotide)5' GAA TCG AT* 3' (8 Nukleotide)5' GAA TCG ATT* 3' (9 Nukleotide)5' GAA TCG ATT CT* 3' (11 Nukleotide)5' GAA TCG ATT CTC 3' (kein dd-Nukleotid wird eingebaut; 12 Nukleotide)
Um später ein Autoradiogramm erstellen zu können, müssen die DNA-Stücke nach der Polymeraseaktion radioaktiv markiert werden. Möglichkeiten dies zu verwirklichen sind der Einsatz
- radioaktiv markierter Primer,
- radioaktiv markierter "normaler" (d-)Nukleotidsorten oder
- radioaktiv markierter dd-Nukleotidsorten.
Dann werden die synthetisierten Doppelstränge denaturiert, also getrennt, und die Einzelstränge für jeden Ansatz getrennt in einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von Harnstoff[2] aufgetrennt.
Nach dem Auftrennen wird auf das Gel ein Röntgenfilm im Dunklen aufgelegt. Nach seiner Entwicklung zeigen sich Schwärzungen durch die entsprechenden Banden des Gels. Die sequenzierte Basenabfolge kann dann ermittelt werden, indem von unten nach oben die Banden durchgegangen werden und die zugehörigen Nukleotide in 5' → 3'-Richtung geschrieben werden.
Nachteile dieser Methode sind die Verwendung radioaktiver Stoffe (teuer, gesundheitsschädigend und umweltbelastend), der aufwendige Arbeitsaufwand und die Tatsache, daß je Probe nur vier Ansätze und vier Geltaschen verwendet werden können. Daher ist keine Automatisierung dieser Methode sinnvoll.
[1]: Didesoxy-Nukletoide
[2]: verhindert die Renaturierung der Einzelstränge zu Doppelsträngen
