2.3.3.2.3 Nichtradioaktive DNA-Markierung (non radioactive labelling)

Aus Biostudies
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Die Verwendung radioaktiv markierter DNA-Stücke hat mehrere Nachteile, z. B. Preis (teuer), Gesundheitsgefährdung, Zeitfaktor, Entsorgung, etc. Daher wird oft eine nichtradioaktive Markierung angewandt. Diese ist ebenso sensitiv und reproduzierbar wie die radioaktive Markierung, besitzt zudem eine hohe Haltbarkeit und kann bei den gleichen Markierungsverfahren verwendet werden.

Im Laboralltag kommen folgende Möglichkeiten zum Einsatz:

  • Verwendung von Digoxygenin-gekoppelten Nukleotiden (z. B. 11-Digoxygenin-dUTP)
Dabei ist DIG (Digoxygenin), ein Steroid, über einen Spacer-Arm an dUTP gekoppelt. Die Detektion erfolgt
  • mit Digoxygenin-spezifischen Antikörpern (Anti-Dig-Antikörper) aus Ziegen oder Kaninchen, an denen wiederum das Enzym Alkalische Phosphatase gekoppelt ist. Dabei katalysiert die Alkalische Phosphatase die Umsetzung der farblosen Substanz BCIP[1] in Gegenwart von NBT[2] zu einem unlöslichen blauen Farbstoff (ein Phenolderivat). Im positiven Fall, wenn die Gensonde an den DNA-Einzelstrang gebunden hat, ist eine blaue Bande auf dem Hybridisierungsfilter sichtbar.
  • mit einem Fluoreszenzfarbstoff, der an den Anti-Dig-Antikörper ankoppelt, z. B. Fluorescein.
  • Verwendung von biotinylierten (Biotin-gebundenen) Nukleotiden
Die Detektion erfolgt dabei
  • mit Hilfe eines Biotin-spezifischen Antikörpers (Anti-Biotin-Antikörper) und daran gekoppelter Alkalischer Phosphatase oder Fluorescein.
  • mit Hilfe des Biotin-spezifischen Proteins Avidin und daran gekoppelter Biotin-gebundener Alkalischer Phosphatase.
  • Verwendung von unmittelbar mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Nukleotiden (z. B. Fluorescein)

[1]: Brom-chlorindolyl-phosphat

[2]: Nitroblau-Tetrazol